2020年11月2日
为了应付大量待测试者，强烈需要用于诊断COVID-19的可靠测定法。 Simon Mügge 博士（生物化学）兼欧洲专利代理人介绍了COVID-19诊断分析中采用的不同方法，证明当前的疫情促进了创新，并为开发诊断分析和设备的公司提供了新的机会。
截至2020年9月30日，世界卫生组织报告全球确诊的COVID 19病例超过3350万，死亡人数1004421人。 在缺乏安全有效的疫苗的情况下，遵守卫生规则，及早发现和隔离受感染的个人是阻止该疾病进一步传播的唯一已知预防措施。 以下文章提供了对COVID-19的体外诊断的基本见解。
新型β冠状病毒SARS-CoV-2是COVID-19的致病性病原体，是一种大型RNA病毒，与引起SARS（SARS-CoV）和MERS（MERS-CoV）的病毒具有高度相似性。 SARS-CoV-2具有四个主要结构蛋白：刺突（S）蛋白，核衣壳（N）蛋白，包膜（E）蛋白和膜蛋白（M）。 N蛋白与RNA基因组结合并在封闭的RNA周围形成衣壳。其它三种蛋白质对于发病机制和病毒复制以及基因组维持至关重要。
粗略地，可以在以下分析中区分用于诊断SARS-CoV-2的分析：（1）旨在直接检测被测样品中的病毒本身；（2）旨在检测被测对象样品中抗体的检测方法，间接表明该对象的免疫系统已受到SARS-CoV-2的攻击。
直接检测病毒本身的检测方法的优势在于，他们可以在疾病的早期阶段检测出SARS-CoV-2的存在，此时受试者的免疫系统尚未形成针对该病毒的抗体。另一方面，据报道在严重的COVID-19情况下，病毒RNA从体内消失的速度没有在非严重情况下那样快。
在这方面，使用最广泛的技术旨在使用一种称为逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法来检测病毒的RNA。
第一步，使用一种称为逆转录酶的酶将病毒的RNA反转录为互补DNA（cDNA）。术语 “反转录” 表示该过程与细胞中的正常过程相反，在该过程中，DNA被用作模板以产生RNA拷贝，然后从细胞核（信使RNA，mRNA）输出并转变成蛋白。
然后将在RT步骤中获得的cDNA与短的DNA链,即所谓的引物混合。这些引物旨在与新SARS-CoV-2病毒特有的序列比对并结合。通常，引物被选择来检测病毒RNA的不同区域，例如编码N蛋白的区域和E蛋白的区域，以增加测定的特异性。如果cDNA包含与一对引物的序列互补的序列，另一种酶（聚合酶）则可以使所述两个引物之间的DNA序列倍增，从而提供确定和预期大小的可检测DNA片段。
每个复制步骤都需要对反应混合物进行加热和冷却循环，如果DNA被复制，其数量则将在温度循环结束时增加一倍。因此，检测所述DNA片段所需的温度循环数允许定量估计样品中存在的病毒量（病毒载量）。因此，可以使所述方法成为定量RT-PCR（qRT-PCR或RT-qPCR）。
最终，复制的样品通过终点对照分析是否存在复制的DNA片段。 如今，特定的染料可用于PCR扩增步骤，该染料可实时检测双链DNA的增加，即增加复制的DNA片段的数目。
该测定法的另一种变化，添加了额外的DNA探针（所谓的Taq-Man探针）。 这些探针也被设计为与复制的DNA片段互补。 与要复制的DNA序列结合后，将释放出荧光染料，随后被荧光读取器检测到。RT-PCR方法特定且灵敏，需要2.5到3个小时，并且需要经过培训的人员进行样品收集，运输和处理。 同时，芬兰的Mobidiag公司等公司开发了一种封闭式药筒系统，该系统简化了操作并进一步加快了测量速度。
Mobidiag的封闭式墨盒测试系统Novodiag®。
已经开发了核酸复制的其他方法，避免了费时的加热和冷却步骤。取而代之的是，在所需的反转录步骤之后，将这些测定设计为在单一温度下高效扩增DNA。
一种最近批准的方法是环介导等温扩增方法（LAMP），它能够在15-60分钟内快速提供结果，且不需要昂贵的试剂或仪器。但是，由于没有使用温度循环，因此LAMP提供了定性结果，仅报告了病毒的存在或不存在。使用荧光染料与扩增的DNA结合进行检测，就像实时RT-PCR一样。
其他LAMP检测技术使用的是用染料和称为生物素的小分子标记的小探针。将这些探针掺入到复制的DNA片段中后，使用生物素结合分子链霉亲和素将这些分子从样品溶液中 “捞出”。最终，使得复制的DNA可以肉眼在测试条上显示为红线。
另一种LAMP测定法使用淬灭探针（Qprobes）。此类QProbes是携带荧光染料的小DNA分子。与目标核苷酸序列杂交后，荧光通过荧光团与目标中鸟嘌呤残基之间的电子转移而淬灭，从而减少了探针发出的荧光信号。
最近开发的一种新方法使用CRISPR相关酶Cas13来快速、便携式地检测SARS-CoV-2 RNA。 Cas13是一种可以编程为选择性结合靶序列的酶， 此处为扩增的RNA。激活后，Cas13裂解同时包含荧光团和淬灭剂的探针，从而释放出荧光团，进而可以对其进行检测。仍然需要对该技术进行进一步优化以实现大规模评估。
广泛用于检测新型冠状病毒的另一种测定法是微阵列测定法。在该检测中，首先将SARS-CoV-2 RNA反转录为用特异性探针标记的cDNA。在第二步中，将这些标记的cDNA与固定在平板（微阵列）孔中的寡核苷酸孵育，使其与微阵列结合。经过几个洗涤步骤以去除未结合的cDNA，可以通过检测特定探针来检测病毒RNA。
SARS-CoV-2的直接检测不限于病毒RNA的检测。而是，几种免疫测定法（使用用于检测的抗体的测定法）用于检测患者样品，如呼吸道样品，血清，血浆或全血中的SARS-CoV-2蛋白。病毒蛋白起抗原的作用，只有在病毒复制时才能检测到。因此，这些测试可用于识别急性或早期感染。
其中，最常用的设置是ELISA（酶联免疫吸附检测）。在这种设置中，首先将病毒蛋白特异的抗体附着到平板上（包被）。将样品与板孵育，使病毒蛋白被抗体捕获。在经过几个洗涤步骤以除去未结合的物质后，将用检测酶标记的第二抗体与平板孵育。如果捕获了病毒蛋白，则所述检测抗体也将与病毒蛋白结合，并且标记的酶在检测步骤中驱动显色反应，并且可以测量形成的颜色。
化学发光测定使用类似的设置，但是通过化学发光进行检测。自动化的样品处理可实现高通量测试，且检出率等于或高于核酸扩增技术。
如上所述，第二组检测旨在检测被测对象血液样本中的抗体，从而间接表明该对象的免疫系统已受到SARS-CoV-2的攻击。尽管与上述方法相比，血液样本的处理更为容易，但这些抗体检测方法仅限于感染后4-10天开始产生IgM抗体，以及感染后10-20天开始产生IgG抗体感染。另一方面，IgM和IgG抗体的量也为初始感染的时间提供了指示，可用于监测感染过程。
ELISA格式是一种非常常见的实验设置。然而，代替捕获抗体，病毒蛋白首先被包被在板上，使得特异性识别病毒蛋白的抗体被捕获并随后使用化学发光或酶驱动的颜色形成进行检测。
甚至更简单的设置是侧流免疫色谱分析（LFIA），这种格式也常用于妊娠试验。要分析的样品扩散通过一条条，其中嵌入了检测抗体，导致抗体-抗原复合物的形成。然后用一系列固定在其位置的抗体捕获复合物。如果存在病毒蛋白，则会出现一条彩色线。
有利地，这些检测可以像从手指上的刺中获得的血滴一样简单地进行。它不需要昂贵的设备或经过专门培训的人员，因此符合测试大量患者的条件。但是，并非所有测试均获得CE标记认可并广泛使用。关于靶向COVID-19的免疫测定的进一步信息，参考例如，由创新新诊断基金会（FIND）。
最后，还应该提到的是，除了SARS-CoV-2特定测试外，COVID-19诊断中还使用了非特定的常规测试，该测试注重有症状的参数变化或参数组合，这适用于COVID-19.
合适的测试可以针对细胞因子水平的变化（证明炎症状态的细胞递质），凝血的变化，白细胞的组成和数量的变化或指示器官中细胞损伤的酶。然而，对这些测定法的进一步讨论将不在本文的范围。
准确性是一种衡量方法正确识别或排除疾病状况的程度。通常，这需要在“灰色”区域内设置阈值。结果，在某些情况下，从感染者获得的值可能低于所述阈值，从而错误地将该人诊断为健康（假阴性结果）。同样，在其他情况下，从未感染者获得的值可能会高于阈值，以致该人被错误地诊断为被感染（假阳性结果）。
如果必须检测所有真正的感染者以抑制疾病的传播（即减少假阴性病例的数量），则可以通过采取设置阈值保守的方法，在该阈值之上，检测结果为阳性，偏低。因此，假阳性测试健康人的数量将增加。
社交媒体最近散布这样一种观点，即受试的COVID-19阳性检测病例数量增加仅仅是由于受检测者的假阳性率高达15％。根据论点，所有测试中有15％表示报告的阳性测试病例增加。但是，所说的假阳性率仅应正确地应用于阳性检测病例的数量。阳性测试病例数的增加意味着所述阳性测试病例的85％被真正感染。因此，即使假阳性的百分比为15％，也有越来越多的阳性测试病例仍真实地报告了测试人群中感染的增加。
考虑到保守方法会大大减少假阴性测试的次数，并且在怀疑患者可以重新测试的情况下，可以认为一定的假阳性率是可以接受的。
哥斯德拥有生命科学领域的专家团队以及在诊断和医疗设备领域具有深厚知识的专家团队，为公司开发创新诊断技术提供支持。 哥斯德帮助在芬兰和欧洲抓住创新驱动的机遇，并与全球值得信赖的合作伙伴合作。 如果有兴趣，我们很乐意与您一起探讨哥斯德的服务如何为您的业务增值。
Simon Mügge
German & European Patent Attorney, European Trademark and Design Attorney
simon.mugge@kolster.com
+358 40 920 8814
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