Patentit  ⋅   Blogit

Millaisilla testi-innovaatioilla on mahdollista selviytyä COVID-19-testausten kasvavista määristä?

01.10.2020
Takaisin

1.10.2020

Luotettaville tekniikoille COVID-19-infektion tunnistamiseen ja diagnosointiin on nyt kova kysyntä, sillä testattavien potilaiden määrä kasvaa koko ajan. Biokemian tohtori, eurooppapatenttiasiamies Simon Mügge kirjoittaa blogissaan käytössä olevista testausmenetelmistä. Koronapandemia tarjoaa uusia mahdollisuuksia innovatiivisille yrityksille. 

Maailman terveysjärjestö WHO on raportoinut jo yli 33,5 miljoonaa vahvistettua COVID 19 –tapausta ja 1,004,421 kuolemaa maailmanlaajuisesti (30.9.2020). Turvallisen ja tehokkaan rokotteen puuttuessa hygieniasääntöjen noudattaminen sekä tartunnan saaneiden henkilöiden varhainen tunnistaminen ja karanteeni ovat toistaiseksi ainoat tunnetut ja ennaltaehkäisevät toimenpiteet taudin leviämisen pysäyttämiseksi.

Artikkeli antaa katsauksen in vitro -diagnostiikan menetelmiin, joiden avulla COVID-19-infektio voidaan määrittää. In vitro on latinaa ja kääntyy ilmaukseksi "lasissa". Se tarkoittaa käytännössä laboratoriotutkimuksia, joissa näyte on otettu potilaasta tai terveestä henkilöstä. 

COVID Diagnostics_Medical test tubes

COVID-19-virus voidaan tunnistaa joko suoraan tai epäsuorasti etsimällä viruksen vasta-aineita 

COVID-19 taudinaiheuttaja, beeta-koronavirus SARS-CoV-2, on suuri RNA-virus, joka on hyvin samankaltainen kuin SARS (SARS-CoV) ja MERS (MERS-CoV) -infektioita aiheuttava virus.

SARS-CoV-2:lla on neljä päärakenneproteiinia: piikkiproteiini (S), nukleokapsidiproteiini (N), vaippaproteiini (E) ja membraaniproteiini (M). N-proteiini sitoutuu RNA-perimään ja muodostaa proteiinikerroksen suljetun RNA:n ympärille. Kolme muuta proteiinia ovat merkityksellisiä sairauden synnyssä, kehityksessä ja viruksen DNA:n kahdentumisessa sekä perimän ylläpidossa. 

Karkeasti SARS-CoV-2-diagnosointimenetelmät voidaan jakaa tekniikoihin, joilla virus voidaan tunnistaa suoraan testinäytteestä sekä tekniikoihin, joiden avulla näytteestä voidaan havaita viruksen vasta-aine. Vasta-aine osoittaa epäsuorasti, että immuunijärjestelmä on alkanut puolustautua SARS-CoV-2:ta vastaan. 

Viruksen suoraan havaitsemiseen tähtäävillä menetelmillä on se etu, että ne voivat tunnistaa SARS-CoV-2:n jo taudin varhaisessa vaiheessa ennen kuin immuunijärjestelmä on alkanut muodostaa vasta-aineita virusta vastaan. Toisaalta on raportoitu, että vakavissa COVID-19-tapauksissa viruksen RNA ei häviä kehosta yhtä nopeasti kuin lievemmissä tapauksissa. 

Corona and trademarks_iStock-628925404

Yleisin RT-PCR-tekniikka monistaa viruksen RNA:ta, jos näytteessä on virusta 

Yleisimmin käytetty tekniikka pyrkii havaitsemaan viruksen RNA:n käyttämällä niin sanottua käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktiota, jolla monistetaan RNA:ta DNA:n muotoon (RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction). 

Ensimmäisessä vaiheessa viruksen RNA:sta tuotetaan täydentäviä DNA-juosteita (cDNA, complementary DNA). Termi "käänteinen" ilmaisee, että prosessi etenee päinvastoin kuin solun normaali prosessi, jossa DNA:sta kopioituu lähetti-RNA (mRNA, messenger RNA), joka kuljetetaan solun ytimen ulkopuolelle ja jossa sen avulla tuotetaan proteiinia.

Käänteisvaiheessa syntyneet cDNA-juosteet sekoitetaan lyhyiden DNA-juosteiden eli alukkeiden kanssa. Alukkeet on suunniteltu kohdistumaan ja sitoutumaan SARS-CoV-2-viruksen DNA-jaksoihin. Tyypillisesti alukkeet on valittu niin, että ne tunnistavat viruksen RNA:n erilaisia alueita kuten N-proteiinia tai E-proteiinia koodaavia alueita taudinmäärityksen tarkkuuden lisäämiseksi. Jos cDNA sisältää alukeparia täydentävän jakson, toinen entsyymi (polymeraasi) voi monistaa näiden kahden alukkeen välisen DNA-jakson ja tuottaa tunnistettavan, määritellyn kaltaisen ja kokoisen DNA-palan.

Jokainen DNA:n kahdentumisvaihe edellyttää sekä lämmityksen että jäähdytyksen käyttämistä vaihdellen, ja jos DNA kahdentuu, sen määrä tuplaantuu aina lämpötilavaihdoksen lopussa. DNA-palan havaitsemiseen tarvittavien lämpötilasyklien lukumäärä kertoo näytteessä olevasta viruspitoisuudesta, joten menetelmää voi käyttää viruksen määrälliseen analyysiin (quantitative qRT-PCR tai RT-qPCR).  

Viimeisessä vaiheessa kahdentunut näyte analysoidaan ja tutkitaan, löytyykö siitä kahdentunut DNA-pala. Nykyään PCR-monistusvaiheessa voidaan käyttää erityisiä väriaineita, jotka merkitsevät kaksisäikeisen DNA:n lisääntymisen eli kahdentuneiden DNA-palojen lisääntyvän määrän reaaliajassa.  

Tekniikasta on olemassa toinenkin muunnelma, jossa käytetään yksijaksoisia DNA-koettimia (ns. TaqMan-koettimia). Nämä koettimet on myös suunniteltu täydentämään kahdentunutta DNA-palaa. Sitoutuessaan kahdentuvaan DNA-jaksoon, koetin vapauttaa fluoresenssivärin, joka voidaan havaita fluoresenssilukijalla. Vaikka RT-PCR-menetelmä on tarkka ja herkkä, se kestää 2,5-3 tuntia ja edellyttää koulutettua henkilöstöä näytteiden keräämiseen ja kuljettamiseen. Tämän menetelmän rinnalle esimerkiksi suomalais-ranskalainen Mobidiag on kehittänyt suljetun kasettipohjaisen testausjärjestelmän, joka yksinkertaistaa näytteiden käsittelyä ja nopeuttaa taudinmääritystä entisestään. 

Mobidiag_Novodiag

Mobidiagin kasettipohjainen testausjärjestelmä Novodiag®.

Uusimmat LAMP-tekniikat säästävät aikaa, sillä lämpötilojen vaihdoksia ei tarvita 

Nukleiinihappojen monistamiseen on kehitetty muitakin tekniikoita, joissa ei tarvita RT-PCR-menetelmän aikaa vieviä lämmitys- ja jäähdytysvaiheita. Käänteiskopiointivaiheen jälkeen nämä menetelmät on suunniteltu monistamaan DNA:ta suurella hyötysuhteella yhdessä lämpötilassa.  

Yksi äskettäin hyväksytty menetelmä on silmukkavälitteinen isoterminen monistusmenetelmä (LAMP, loop-mediated isothermal amplification method), joka pystyy tuottamaan testituloksia niinkin nopeasti kuin 15-60 minuutissa, eikä se edellytä kalliiden kemiallisten yhdisteiden tai instrumenttien käyttöä. Koska lämpötilavaihdoksia ei käytetä, LAMP antaa tuloksen, joka osoittaa ainoastaan viruksen läsnäolon tai sen puuttumisen, ei sen määrää. Virus voidaan havaita käyttämällä fluoresenssiväriainetta, joka sitoutuu monistettuun DNA:han, samalla tavalla kuin reaaliaikaisessa RT-PCR-menetelmässä.  

Muut LAMP-tekniikat käyttävät pieniä koettimia, jotka on merkitty väriaineella ja pienellä molekyylillä, jota kutsutaan biotiiniksi. Kun nämä koettimet yhdistetään monistettuun DNA-palaan, molekyylit voidaan "kalastaa" näytteestä käyttämällä biotiinia sitovaa molekyyliä streptavidiinia. Tämä mahdollistaa sen, että monistettu DNA voidaan tehdä silmälle näkyväksi punaisena viivana testiliuskassa.  

Eräs LAMP-tekniikoista käyttää sammutuskoettimia (quenching probes, Qprobes), jotka ovat pieniä fluoresenssiväriainetta sisältäviä DNA-molekyylejä. Kahden nukleiinihapon sitoutuessa tosiinsa fluoriloiste sammutetaan elektronien siirrolla fluoroforien (aktivoituvat valolla) ja guaniiniryhmän (heijastaa valoa) välillä. Se vähentää koettimen lähettämää fluoriloistesignaalia paljastaen viruksen olemassaolon.  

Äskettäin kehitetyssä uudessa menetelmässä käytetään CRISPR Cas13 -entsyymiä taudinaiheuttajaviruksen RNA:n nopeaan tunnistamiseen kannettavalla testilaitteella. Cas13 on entsyymi, joka voidaan ohjelmoida sitoutumaan valittuun kohteeseen, tässä tapauksessa monistettuun RNA:han. Aktivoituna Cas13 katkaisee koettimen, joka käsittää sekä fluoroforin että sammuttimen, jolloin vapautuu fluorofori, joka puolestaan ​​voidaan havaita. Tämän tekniikan optimointi edellyttää laaja-alaisempaa jatkotutkimusta.

Koronaviruksen tunnistamiseen käytetään laajasti myös mikrosirutekniikkaa. Siinä SARS-CoV-2:n RNA muunnetaan ensin käänteisesti täydentäviksi cDNA-juosteiksi, jotka on merkitty erityisillä koettimilla. Toisessa vaiheessa näitä merkittyjä cDNA:ita haudutetaan mikrosirulevyn kuoppiin kiinnitettyjen oligonukleotidien eli lyhyiden nukleotidipätkien kanssa siten, että ne sitoutuvat mikrosiruun. Useiden pesuvaiheiden jälkeen, joissa poistetaan sitoutumaton cDNA, viruksen RNA voidaan havaita erityisten koettimien avulla.  

ELISA-testit mahdollistavat laajan testauksen 

SARS-CoV-2:n suora havaitseminen ei rajoitu virus-RNA:n havaitsemiseen. On useita immuunitekniikoita, joissa käytetään viruksen vasta-aineita SARS-CoV-2-proteiinin havaitsemiseksi potilaiden hengitysteiden näytteistä, veriseerumista, -plasmasta tai suoraan verestä. Virusproteiinit toimivat immuunivasteen laukaisevina antigeeneinä, jotka havaitaan, kun virus monistuu. Siksi näitä testejä voidaan käyttää tunnistamaan akuutti tai varhainen infektio.

Näistä yleisimmin käytetty tekniikka on ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Tässä menetelmässä testilevy päällystetään ensin virusproteiinin vasta-aineella. Näytettä haudutetaan levyllä, jolloin vasta-aine voi kiinnittyä virusproteiiniin. Useiden pesuvaiheiden jälkeen sitoutumattoman materiaalin poistamiseksi levyä käsitellään toisen vasta-aineen kanssa, joka on merkitty entsyymillä havaitsemista varten. Jos virusproteiini kiinnittyi, tämä toinen vasta-aine sitoutuu myös virusproteiiniin, ja merkitty entsyymi tuottaa värireaktion, ja muodostunut väri voidaan mitata.

Kemiluminesenssia eli kemiallista valon säteilyä hyödyntävässä tekniikassa käytetään samanlaista menetelmää, mutta havaitseminen tapahtuu kemiluminesenssin kautta. Automatisoitu näytteiden käsittely mahdollistaa korkean suorituskyvyn testauksen, ja virus tunnistetaan yhtä suurilla tai korkeammilla prosenteilla kuin nukleiinihappomonistustekniikoilla.  

Vasta-aineisiin perustuvat tekniikat eivät mahdollista viruksen varhaista havaitsemista 

COVID-19-diagnostics

Menetelmät, jotka perustuvat vasta-aineiden havaitsemiseen testatun henkilön verinäytteestä osoittavat epäsuorasti, että immuunijärjestelmä on altistettu SARS-CoV-2-virukselle. Näissä menetelmissä verinäytteiden käsittely on helpompaa kuin näytteiden käsittely muissa edellä kuvatuissa menetelmissä, mutta testausten rajoitteena on se, että IgM-vasta-aineet alkavat kehittyä vasta 4-10 päivän jälkeen tartunnan saamisesta ja IgG-vasta-aineet 10-20 päivän jälkeen. Toisaalta molempien vasta-aineiden määrä antaa tietoa tartunnan ajankohdasta, ja sitä voidaan hyödyntää taudin seurannassa.

ELISA-menetelmä on hyvin yleisesti käytetty vasta-aineisiin perustuva testaustekniikka. Siinä testauslevy päällystetään ensin virusproteiinilla siten, että ne vasta-aineet, jotka tunnistavat virusproteiinin, kiinnittyvät ja havaitaan myöhemmin kemiluminesenssillä tai entsyymivälitteisellä värinmuodostuksella.  

Vielä yksinkertaisempi testaustapa on LFIA-menetelmä (lateral flow immunochromatographic assay), jota käytetään yleisesti myös raskaustestissä. Analysoitava näyte imeytetään liuskan läpi, johon on upotettu viruksen havaitsemisessa tarvittavia vasta-aineita, mikä johtaa vasta-aine-antigeeniyhdistelmän muodostumiseen, mihin yhdistelmään toiset vasta-aineet kiinnittyvät. Jos näyte sisältää viruksen, liuskaan ilmestyy näkyviin värillinen viiva. Etuna on, että testaus voidaan suorittaa yksinkertaisesti sormesta otettavalla veripisaranäytteellä. Menetelmä ei vaadi kalliita laitteita tai erikoiskoulutettua henkilökuntaa, ja siksi se soveltuu suurien potilasmäärien testaamiseen. Kaikki vasta-ainetestit eivät kuitenkaan ole CE-merkinnällä hyväksyttyjä eivätkä laajasti saatavilla. Lisätietoa immuunimenetelmistä löytyy esimerkiksi Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND) -sivustolta.

Epätäsmällisetkin testit ovat apuna COVID-19 diagnosoinnissa

Tarkkojen SARS-CoV-2-testien lisäksi koronaviruksen diagnosoinnissa käytetään apuna myös epätarkkoja rutiinitestejä, jotka keskittyvät COVID-19:lle tyypillisten parametrien tai parametrien yhdistelmien muutoksiin.

Tällaiset testit voivat kohdentua esimerkiksi tulehdustiloja osoittavien sytokiinitasojen muutoksiin, veren hyytymismuutoksiin, muutoksiin valkosolujen koostumuksessa ja määrässä tai entsyymeihin, jotka viittaavat elinten soluvaurioihin.

COVID Diagnostics

Väärät positiiviset tulokset COVID-19-diagnostiikassa ─ nekin on hyväksyttävä

Testimenetelmien tarkkuus on mittari sille, miten hyvin testi tunnistaa oikein tai sulkee pois sille annetun ehdon. Usein näiden tarkkuusmittareiden raja-arvojen määrittelyssä liikutaan ’harmaalla’ alueella. Tartunnan saaneelta henkilöltä saadut arvot voivat joissakin tapauksissa olla annetun raja-arvon alapuolella, jolloin henkilö diagnosoidaan virheellisesti terveeksi (väärä negatiivinen tulos). Vastaavasti tartunnan saamattomalta henkilöltä saadut arvot voivat olla kynnysarvon yläpuolella siten, että henkilöllä diagnosoidaan virheellisesti tartunta (väärä positiivinen tulos).  

Mikäli on todella tärkeää tunnistaa kaikki tartunnan saaneet henkilöt ja estää taudin leviäminen, toisin sanoen vähentää väärien negatiivisten tulosten määrää, silloin konservatiivinen lähestymistapaa on asettaa raja-arvo melko alhaiseksi. Silloin puolestaan väärien positiivisten testitulosten määrä terveillä henkilöillä kasvaa. 

Sosiaalisessa mediassa levisi hiljattain väite, jonka mukaan positiivisten COVID-19-tapausten lisääntyvä määrä johtuu pelkästään positiivisten testitulosvirheiden osuudesta, jonka väitettiin olevan niinkin korkea kuin 15 % kaikista testeistä. Väärien positiivisten tulosten määrä tulisi kuitenkin suhteuttaa ainoastaan kaikkien positiivisten testitulosten määrään. Positiivisten tapausten määrän kasvu tarkoittaa siten, että 85 % positiivisen tuloksen saaneista todella on saanut tartunnan. Vastaavasti, vaikkakin 15 % olisi vääriä positiivisia tuloksia, kasvava määrä positiivisia tuloksia kertoo silti infektioiden lisääntymisestä testatussa väestössä.  

Kun otetaan huomioon, että konservatiivinen lähestymistapa laskee huomattavasti väärien negatiivisia tulosten määrää, ja epäselvissä tapauksissa potilaat voidaan vielä testata uudelleen, väärien positiivisten testitulosten jonkinlaista osuutta voidaan pitää hyväksyttävänä. 

Kolsterin bioteknologian ja kemian patenttitiimillä on syvällistä osaamista myös diagnostiikan ja lääkinnällisten laitteiden innovaatioiden suojauksesta. Tutustu tiimiimme!

Ota yhteyttä

Simon Mügge
German & European Patent Attorney, European Trademark and Design Attorney
simon.mugge@kolster.com
040 920 8814

LUE LISÄÄ

Mobidiagin avulla testataan suuri osa suomalaisten koronavirusnäytteistä – IPR suojaa innovaatiot

Mitkä ovat COVID-19-rokotekehityksen haasteet, edistysaskeleet ja mahdollisuudet?

Koronarokote luo ainutlaatuista globaalia yhteistyötä lääkekehitykseen

Kokemus, skaala ja kansainvälisyys: Kolsterin vahvan bioteknologian ja kemian tiimin kolme peruspilaria

Patentti on loistava tapa taistella ilmastonmuutosta vastaan – näin vihreän teknologian innovaatiot kannattaa suojata

SIMON MÜGGE

Simon Mügge on immunologiaan erikoistunut biokemian tohtori ja kokenut patenttiammattilainen, jolla on sekä eurooppapatenttiasiamiehen että saksalaisen patenttiasiamiehen pätevyydet. Hänellä on vahva tieteellinen tausta ja yli kymmenen vuoden kokemus immateriaalioikeuksista Saksassa ennen siirtymistään patenttiasiamieheksi Kolsterille marraskuussa 2019. Hän hoitaa hakemuksia Euroopan patenttivirastoon (EPO) ja Saksan kansalliseen patentti- ja tavaramerkkivirastoon (DPMA), lisäksi hänellä on erikoisosaamista patentin myöntämisen jälkeisistä väite- ja valituskäsittelyistä. Hän toimii asiantuntijana sekä rinnakkais- että alkuperäislääkevalmistajien välisissä patenttikiistoissa; parhaillaan Polpharma/Sandoz -väitekäsittelyissä vastapuolena Biogen sekä patentinhaltijan Rigontec/Merck edustajana. Simon Mügge palkittiin Managing IP Rising Star -palkinnolla vuosina 2018 ja 2019.